1. 凝胶层析的分离方式

        凝胶层析按其分离方式，主要可分为组族分离和分级分离两大类型。

1.1 组族分离：

        组族分离是将样品中的各组分分成大小不同的两类分子，然后从低分子量物质中分离出高分子量的物质，或者从高分子量物质中除去低分子量物质的一种分离方法。在这种情况下，高分子量的物质完全被凝胶层析介质所排阻，不能扩散进入凝胶颗粒的内部，而随洗脱液流出层析床；小分子量物质则可以扩散进入凝胶颗粒内，洗脱体积几乎相当于床体积。这种被分离物质之间在分配系数上有极为明显的差别，称为组分离、组别分离或组族分离。

        组族分离常用于生物产品的制备工艺中，如脱盐，即小分子盐与生物大分子的分离，或在生物制品的最后阶段脱除低分子物质的精制工序等。组族分离，只能将样品达到粗分离的目的，只有分子量相差悬殊的物质才能得以分离，分子量相差越大，分离效果越好。这种分离方法的应用范围比较广泛，如在电泳和离子交换层析前工作液的脱盐、样品中缓冲液的替换、蛋白质的脱盐、核酸制备中酚及无机盐等小分子的去除等。由于这种操作具有方便易行、设备简单、蛋白质回收率高且样品稀释度低等优点，长期在制备分离中广泛应用。目前凝胶层析蛋白质脱盐工艺，几乎完全替代了透析法。脱盐工艺中凝胶层析介质的体积通常为样品体积的4~5倍，流速可达200cm/h左右。

1.2 分级分离：

        分级分离是将分子大小相近的物质分开，其分辨率要比组族分离高，但有时洗脱曲线之间会产生洗脱峰的重叠。分级分离常用于物质的分析，如分子量的测定，生物制品在精制时也采用分级分离，即为获取高活性部分的生物制品，得到纯品的精制过程。这种方法要使物质完全分离是比较困难的，受到多种因素的影响。选择适当的分离介质尤为重要，必须采用孔径适当、分离范围与分子大小相适应的凝胶介质。在操作方面，样品的上样量较少，仅为床体积的5%~10%，因此这种分离常用于经过浓缩后的样品。把分离柱加长，可提高分离效果，但会增加床的压力降，减低流速。

        组族分离和分级分离二者不但在应用方面有区别，在操作方面也有所不同。组族分离的上样量较大，分离容量大，但分辨率低；而分级分离的上样量少，分离容量小，但分辨率高。但是，这二者之间并没有截然的区别。除脱盐及分级分离外，凝胶层析还适用于变性蛋白质的复性及中草药有效成分提取分离等工艺，也可进行多肽、蛋白质、核酸及其它大分子物质分子量的测定及缓冲液的置换。

2. 凝胶层析介质的选择

2.1 类型的选择：

        在进行组族分离时，因为被分离物质的分子量差距较大，因此易于选择凝胶。通常选用孔径小、排阻极限小的凝胶。由于凝胶层析介质的孔隙小，盐等小分子可以扩散进入凝胶颗粒内部，而大分子不能扩散进入，沿液体的流动方向从柱中流出，达到分离的目的。

        对于分级分离，凝胶的选择非常重要，因为被分离物质的分子量接近，要根据被分离物质的分子量及各种凝胶的选择性特性曲线进行选择。一般先选择排阻极限较低的凝胶，这类介质由于孔径小，珠体的刚性较强，流速可以有较大的选择范围，有利于操作，使被分离物质的洗脱较快，且活性物质的活性回收率较高。若是在水溶液中操作，则选择亲水性的介质；若是在疏水性的有机溶剂中进行分离，则必须选用疏水性的介质。

2.2 型号的选择：

        在组族分离时，凝集介质的选择比较容易，因为要分离的两类组分在分子量上又很大的差异，因而容易进行完全地分辨。应选择分子量在排阻极限以上的凝胶介质，是大分子量的物质不扩散进入凝胶内部，在外水体积时洗脱，这样区带的扩散和稀释程度最小，并能减少目标产物留在柱上的时间。脱盐工艺中常选用中等粒径的葡聚糖凝胶。相对分子质量低至5000的目标产物组分需要脱盐时，都可以选用它。这类凝胶介质具有较好的刚性、优良的通透性及较好的流速。

        对于分级分离而言，选择凝胶介质是一项重要的工作，因为需要分离的物质是一系列分子量接近的成分。选择时需要考虑被分离物质的分子量与凝胶介质的选择性曲线，即必须考虑凝胶介质的分离范围，如果凝胶介质选择不当，会使几种被分离的物质几乎同时从柱中流出，或可以同时在凝胶介质的孔中扩散，而得到的分离谱图的洗脱峰都在外水峰中，或洗脱峰重叠，达不到分离的目的。

        如果在分离中需要使用解离剂或洗涤剂时，凝胶介质的选择更应注意，要考虑到它们对被分离分子的构型所产生的影响。因为用一些洗涤剂作为助溶剂对一些水溶性较低的膜蛋白组分尤为合适，但对蛋白质的构型有一定的影响，因此要选用孔径更大一些的凝胶介质较为合适。

        由于各种凝胶介质的分类范围有时会部分重叠，对一些目标产物可选用的分离介质也可能不止一种。这时通常可选择排阻极限较低的凝胶介质，以使目标产物洗脱较快，还有可能提高目标产物的活性回收。此外，对于化学结构相同的凝胶介质，低排阻极限者往往有更佳的刚性，应用时可在较大的范围内选择流速，有利于生产效率的提高。

2.3 粒径的选择：

        介质的粒径要根据具体的实验情况而选择，尤其要根据分类对象及要求达到的目的而选择。粒径较小的分离介质，颗粒在柱内易于分布均匀，形成的层析带扩散较小，分辨率高，但流速较慢，主要用于分辨率要求较高的分级分离，适用于分析层析、小柱操作、少量样品的精制及分子量的测定等。粒径较大的分离介质，柱的通透性好，流速较快，适宜于处理大量的工作液，如脱盐或分子量较大的物质之间的分离，因而在规模生产中，多选用粒径较大的介质。但无论选择哪种类型的分类，都要求介质具有较窄的粒径分布，因为粒径分布越均匀，柱的分辨率就越高，越易得到理想的分离效果。

3. 凝胶层析柱的选择

3.1 柱结构的选择：

        为了获得最佳的凝胶层析效果，应注意柱体设备的选用。层析柱是凝胶层析技术中的主要部件，一般用玻璃管或有机玻璃管。在柱的下部应有孔径分布均匀的筛板，以利于流动相均匀地流出，防止柱内液体的偏流。在层析柱的滤板下，死体积应尽量地小，如果支撑滤板下的死体积大，则被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果将影响洗脱峰形，出现拖尾现象，降低分辨率。在精确分离时，死体积不能超过床体积的千分之一。

        在选用层析柱的材质及柱体时，还必须考虑柱的耐压及耐溶剂性。柱体及各连接部件都必须选用耐酸碱及耐有机溶剂的材质，以利于延长层析柱的使用寿命，并可避免对分离物的污染。

3.2 柱内径的选择：

        虽然层析柱直径的大小不影响分离度，但也要选用内径合适的柱体。较细的柱体有时会产生管壁效应，而直径过大，则稀释将成为一项不利的因素。柱体的直径应根据分离物的量来选用，在加样时应将样品均匀地分布于凝胶层析柱的床面上。制备用的凝胶层析柱，直径一般大于2cm，样品量较大时，可加大柱的直径。柱的直径加大后，洗脱液的体积将增大，样品的稀释度也将加大。

3.3 柱长度的选择：

        凝胶层析中两个被分离区带的分离度取决于柱的高度，为分离不同的组分，层析柱必须有合适的高度，分辨率与柱体长度的平方根而成正比。因此适宜选用较长的柱体，尤其是分级分离，以便于获得最佳的分辨率。但对于某些基质较软的凝胶介质，若床柱过高，珠体受挤压会发生变形，影响流速，所以一般应不超过1米。通常在进行组族分离时，层析柱的长度大多在2~30cm之间，在进行分级分离时，层析柱的长度需要100cm左右。层析柱的直径一般在1~5cm之间，小于1cm易产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。层析柱的长度与直径的比值一般宜在7~10之间，但对移动慢的物质，宜在30~40之间。对于分离精度要求较高的工艺，也可采用层析柱串联的方法，可以提高层析柱的分辨率。

        选择层析柱的一般原则是，柱的长度取决于工艺所要求的分辨率，而柱的内径则取决于被分离样品的量。在进行脱盐时，将所需体积的凝胶介质充装在短而粗的柱体内，是最佳的脱盐系统，这样可以取得较大的体积流速，提高脱盐的速度，减少对样品的稀释。而不宜选用长而细的柱体。

4. 凝胶层析操作中应注意的事项

4.1 凝胶层析介质的溶胀、装柱：

        商品凝胶层析介质有的为干燥颗粒，使用前先进行水合膨胀，也可直接在洗脱液中进行溶胀。溶胀必须彻底，否则影响层析的均一性，甚至会有层析柱胀裂的危险。将凝胶介质颗粒直接放入水或洗脱液中，搅拌均匀，在室温下经过10小时左右即可得到较充分的溶胀。为了加速溶胀，也可进行加热，即在沸水浴中将湿的凝胶浆逐渐升温接近沸腾，这样可大大加速溶胀的速度，约1~2小时即可达到平衡。加热溶胀不但可以节省时间，还可消毒，除去凝胶介质中的污染物和排除凝胶内的气泡。

        凝胶层析介质充分溶胀后即可进行装柱。层析柱安装时要保证垂直，一般用泵将凝胶浆打入柱中。目前无论实验室或规模生产，都可以采用装柱机进行装柱，这样可使柱内的介质分布均匀，而且装柱的速度也很快。如果是人工装柱，应将搅拌均匀的凝胶介质一次性倒入柱中，不能产生分层现象。装柱后必须检验柱中介质是否分布均匀，有无“纹路”或气泡，这样才能保证层析正常工作。在凝胶层析操作中，装柱是影响分离效果的一个重要步骤，为确保装柱效果，在装柱后可用1%的丙酮进行柱效测定，测定其理论塔板数。

4.2 柱的重复使用及保存：

        凝胶层析介质不会与被分离物质发生任何作用，因而在层析分离后，只要稍加平衡就能进行下一周期的工作，这是凝胶层析介质的优点之一。因此凝胶层析介质在装柱后可以反复使用，不必特殊处理，而不影响分离效果。琼脂糖系列的介质，一般是以湿态出售，并保存在乙醇溶液中，因此在使用前应先用大量的纯水洗去乙醇后再进行分离工序。

        在实际操作中，常有一些杂质污染凝胶介质或层析床的表面，因此必须进行适当的处理，清除这些“污染物”。应根据污染的情况来决定处理的时间。一般情况下，轻微污染可以忽略，继续使用。当层析介质颜色发生明显变化，甚至层析柱表面出现沉淀物，使表面有明显板结时，则必须进行处理。除对样品进行预处理外，对层析柱也要进行净化处理。如果沉淀物与温度有关，可以用温水或适当的缓冲液进行洗涤，使沉淀溶解、去除。如果难以溶解，就必须将严重污染的表层介质挖掉，并添加新的层析介质。被污染的层析柱，可用0.2mol/L的NaOH和0.5mol/L的NaCl混合溶液进行处理。这种方法，通常可洗掉一些污染物。

        如果污染严重，或层析柱经过若干次使用后，出现介质的色泽改变，流速降低，表面有污染物等情况时，必须采用适当的方法进行处理，恢复其原来的性质和功能，这就是所谓的再生。对于多糖类的介质，可采用温热的0.5mol/L  NaOH和0.5mol/L  NaCl混合溶液缓慢通过层析柱，甚至可以浸泡一段时间，以清除污染物，恢复层析柱的功能。

        经常使用的层析柱以湿态保存为好，只要在其中加入合适的防腐剂就可以防止几个月甚至一年，并不需要将介质干燥。特别是琼脂糖介质，不但干燥操作繁杂，而且干燥后不易溶胀，因此一般都以湿态保存。为了防止凝胶层析介质中滋长细菌，可将其保存在20%的乙醇溶液中，或碱性溶液中。尤其是乙醇溶液浸泡，已成为目前通用的保存方法。

4.3 对分离样品的要求：

        待分离的样品必须无沉淀，且粘度不可太大，否则将影响分离的效果。因此在进行层析之前，样品应进行预处理，除去其中的不溶性杂质，若能经过超滤等方式除去其中的胶体物质，不但可提高分离效果，还利于延长层析柱的使用寿命。

        根据分离模式的不同，上样量略有差别，分析性分离及分级分离都需要最大的分辨率，与柱长相比，要求起始区带的宽度应非常狭窄。此时样品体积最好是柱体积的1%~5%。即使再减小样品的上样量，一般也不能再提高分辨率。对于组族分离及某些分级分离的实验中，峰的分离良好，通过实验设计可以增加样品量，一般样品液量可达凝胶层析床体积的10%。在蛋白质溶液除盐时，有时样品量也可高达凝胶层析床体积的20%~30%。上样量适宜，洗脱出的峰形才能较好，才能提高分辨率。在规模生产中，为了提高生产效率，在能保障产品纯度的情况下，可尽量加大样品的用量。

        样品的粘度也是影响上样量和层析柱分离效果的因素之一。粘度往往限制了所能采用的最高浓度用量。样品浓度过高，使区带不稳定，流速也不规则，这样会使峰带严重扩宽和扭曲，影响分离效果和上样量。此时应使用适当的缓冲液降低样品的粘度。

        凝胶层析常作为下游的最终精细纯化步骤，通常与其它的工艺或其它的柱层析联合使用，例如肽、多糖、酶、重组蛋白、抗体及大蛋白等，样品已经过初步纯化、浓缩，选用适当的上样量，可以得到满意的分离效果。

4.4 洗脱剂的选用：

        在凝胶层析中，洗脱剂往往不直接影响分辨率。对于完全不带电荷的物质，可用蒸馏水进行洗脱，带电荷物质的凝胶层析，可用适合的缓冲液进行洗脱，以控制pH值。对于多糖类的分离介质，缓冲液的离子强度至少应为0.02mol/L。对于聚丙烯酰胺类的凝胶介质，离子强度为0.05mol/L。使用一定离子浓度的缓冲液，其目的是防止被分离物质与凝胶介质骨架间的离子相互作用。有时在凝胶介质的分级分离中，为避免生物大分子与凝胶介质产生非特异性吸附，甚至可在缓冲液中加入0.1~0.2mol/L的NaCl。

5. 流速的选择：

        一般情况下，增加流速往往会使分辨率下降，在使用长柱和低流速时，可以取得最大的分辨率，使用短柱和高流速时可以得到快速的分离。由此可见，良好的分辨率和分离时间是相互矛盾的。由于分离的物质不同，柱的结构不同，必须根据所要求的分辨率进行实验，确定最佳的流速以得到满意的分离效果。

        综上所述，凝胶层析工艺参数对分离纯化的效果有明显的影响，不但凝胶层析介质种类的选择有重要影响，其它各工艺参数，如柱的高径比、流速、介质的床高等因素都影响分离效果。而参数的确立，要根据待分离的物质及所要求的纯度，通过实验而确定。